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葡萄糖氧化酶及其在猪生产中的应用研究进展

作者:    发布时间:2017-10-17 17:34:42    所属栏目:公司新闻

      我国饲用酶制剂经过30多年的发展,主要应用在以下两大领域:一是补充动物体内消化道酶的不足,直接提高日粮营养的消化利用(脂肪酶等外源性消化酶);二是消除饲料中的抗营养因子,间接改善日粮营养的消化利用(木聚糖酶等非淀粉多糖酶)。许多试验和实际应用结果都表明,饲用酶制剂作为一种饲料添加剂能?#34892;?#22320;提高饲料的利用?#30465;?#20419;进动物生长和防止动物疾病的发生,与抗生素和激素类物质相比具有卓越的安全性,引起了全球范围内饲料行业的高度重视。然而过去酶制剂饲料应用取得的成功也是基于这些方面的研究和认识,饲料酶制剂发展到现在,正面临新的突破和拓展。在食品安全和饲料安全的大趋?#33889;攏?#31105;止使用抗生素的所谓“无抗”养殖有一个艰难的过程。2015年,中国打响了“饲料禁抗”的第一枪,农业部首次正式发布“禁抗令”。“饲料禁抗”是畜牧业发展的必然趋势,是保障食品安全、推动健康养殖的必由之路。而以葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)为代表的“第三代分解型酶制剂”,是一种潜力很大的酶制剂,其通过非药物性机制和途径杀菌抑菌改善动物消化道的微生态及理化?#32938;?#30340;作用,从而提高动物的生产性能。为饲料酶制剂在替代药物抗生素的健康养殖中开辟了一个新领域。
      葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)是一种通过分子氧作用将β-D-葡萄糖催化生成葡萄糖酸和H2O2的一种黄素糖蛋白。GOD早在1928年由Muller发现,一年之后Fleming从点青霉中分离提纯得到GOD。GOD能从很多不同的真菌中提纯而来,目前主要从黑曲霉和青霉中分离,其中从青霉中分离的GOD表现出更好的动力学优势。GOD来源广泛,分布于动物、植物及微生物体内,是一种安全无毒副作用的新型酶制剂。然而目前,系统阐述GOD对猪生产性能影响的报道还很少。因此,为了方便人们系统的了解GOD在猪饲养中的研究进展,本文从GOD的酶属性、对猪生长性能、免疫功能及肠道微生物四个方面介绍了GOD对猪生产性能的影响及其机制,并指出了当前GOD在养猪业上存在的问题及应用有待研究的问题,同时对饲用GOD的应用发展提出了几点建议和展望,以便我们对GOD有更深入了解,开发出好的复合型饲料添加剂。
      葡萄糖氧化酶属性
      高纯度的GOD为淡黄色晶体,易溶于水,不溶于乙醚,氯仿、?#35270;?#31561;,分子量为15万单位左右:Frederick等将编码GOD的基因植入酵母中,随后?#32622;?#20986;酶,发现GOD含有两单位黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD),而结合在葡萄糖较深处FAD能够在细胞呼吸代谢中催化物质氧化还原反应,葡萄糖结合的活性位点在FAD的上面,处于较深的立体结构中。GOD在pH值为4.8~8.0之间具有很好的稳定性,最适pH值为6.0,而pH值大于8或小于2时,会导致酶的迅速失活。猪胃、小肠中的pH值?#30452;?#20026;2.0~5.4、6.5~7.2,因此GOD能够在小肠中更好的发挥作用。GOD作用温度为20~60℃,最适温度35℃。GOD耐温性能及存储稳定性良好,经85℃处理1 min,酶活保持在80%以上,避光、干燥处保存12个月活力不低于90%。

      GOD能从很多不同的生物中提纯而来,包括真菌、红藻、柑橘、昆虫、细菌类等,目前生产中主要从黑曲霉和青霉中分离,两种菌株生产的GOD具有类似的碳水化合物,其中主要包括葡萄糖、甘露糖和氨基己糖,其中,黑霉产GOD含有更多的甘露糖和氨基己糖。两?#32622;?#20135;的GOD最适pH值范围也不相同,黑曲霉和青霉产的GOD的最适pH值范围?#30452;?#26159;3.5~6.5,4.0~5.5。米氏常数(Km)表示酶和底物之间的亲和能力,Km值越大,亲和能力越弱,反之亦然。在同等底物浓度的条件下,Km值越大,其所需的酶浓度越大,即所需添加量也越大。因而,青霉源的葡萄糖氧化酶拥有更高的底物结合能力,反应速率更快。
      GOD的催化反应,在没有过氧化氢酶情况下,生成葡萄糖酸和过氧化氢;在有过氧化氢酶存在条件下,生成葡萄糖酸;在乙醇和过氧化氢酶存在情况下,生成葡萄糖酸、乙醛和水。
      葡萄糖氧化酶对猪生产影响及其机制
      β-D-葡萄糖与O2在GOD的催化作用下,生成葡萄糖酸和少量H2O2。首先耗氧,表现出其抗氧化的功能:赵文研究表明:机体内产生的氧自由基会破坏肠道上皮细胞的完整性造成肠道损伤。另外,GOD的辅基是FAD,因而GOD能够消除氧自由基,保护肠道健康,从而抑制病原菌的入侵。其次,产生的葡萄糖酸是一种有机弱酸,能够降?#32479;?#36947;pH值。而酸性?#32938;?#26377;助于保?#27542;?#36947;菌群生态平衡,提高消化酶酶活及饲料消化率等作用。葡萄糖酸主要被乳酸菌发酵并且刺激丁酸盐的产生,当其到达肠道后段时,能?#40644;?#24687;的菌群所利用,生成丁酸等短链脂肪酸,进而为肠道供能,而在小肠中很少被吸收,因而具有类似益生元的性?#30465;?#26368;后产生的少量H2O2经大量累积后能够起到类似广谱抗菌的作用,能够?#34892;?#32531;解霉菌毒素中毒,保护肠道健康,因而GOD也是目前替代抗生素的重要产品之一。
       对猪生长性能的影响
      动物肠道微生态也是一种动态平衡的稳态值中,首先GOD催化过程中耗氧,因为肠道中大部分病原菌都是耗氧菌,而有益微生物基本都是厌氧菌或兼性厌氧菌,而GOD催化过程中产生的过氧化氢能够起到广谱抗菌的作用。因而GOD催化反应有助于增殖有益菌,从而抑制大肠?#21496;?#27801;门氏菌、巴?#32454;司?#33889;萄球菌、弧菌等有害菌的增殖,过氧化氢抑菌过程是一个动态的过程,它杀灭细菌的同时,促进有益菌增殖,从而达到维?#27542;?#36947;菌群平衡,保证动物健康。另外,胃蛋白酶原是在胃蛋白酶或者盐酸的刺激下激活,因此pH?#21040;?#20302;有助于激活胃蛋白酶原,产生胃蛋白酶。因此,GOD能够提髙饲料消化率,改善动物肠道健康和消化能力,提高饲粮营养物质消化和吸收效率,促进动物生长。殷骥等在日粮中添加0.05%含45U/g的GOD,结果表明,与对照组相比,试验组日增重提高7.03%(P<0.05),料重比降低2.75%(P<0.05),?#32938;?#27611;利润增加16.35元,增幅10.08%。汤海鸥等也发现,仔猪饲粮中添加100g/tGOD,试验组平均日增重为0.48kg,比对照组提高了35g?#40644;?#22343;日采食量为0.884kg,比对照组提高了39g;料重比比对照组降低了0.067;从而改善仔猪生长性能。陈清华等在仔猪饲粮中?#30452;?#28155;加200g/t GOD、0.1%金霉素作为试验I、II组,发现添加GOD组日增重、平均采食量、料肉比及腹泻?#31034;?#26174;著优于对照组,且效果比金霉素组明显,说明GOD对动物生长性能、肠道健康均有所改善,且可替代金霉素。宋海彬等报道,在仔猪饲粮中添加0.5% GOD,其在增加采食量、促进生长、提高饲料转化?#30465;?#20943;少腹泻率等方面都有明显效果。在断奶仔猪饲料中添加GOD,发现与对照组相比,添加量为100mg/kg组平均末重和平均日增重?#30452;?#21319;高了5.07%、8.49%;添加量为200mg/kg组?#30452;?#21319;高了10.18%、16.03%,且经济效益以200mg/kg添加组毛利润最高,提高了24.13%。安文亭等研究结果表明,GOD可提髙试验组仔猪饲料能量、蛋白?#30465;?#33026;肪和纤维消化率,生产性能和健康水平改善,试验组的平均日增重比对照组提高12.15%~24.83%,料重比下降7.09%~10.64%,腹泻率降低24.58%~48.76%,死淘率降低12.35%~55.76%。方金津等研究表明,GOD可通过催化作用,改善杜洛克x山仔猪肠道形态结构,降低胃和十二指肠pH值,并产生大量的乙酸、丙酸、n-丁酸等短链脂肪酸(SCFAs),而SCFAs能进入盲肠和结肠对胃肠道的生长、发育具有调控作用,可为结肠上皮提供60%~70%的能量,从而提高机体对营养物质的消化吸收,使仔猪的生长性能得到充分发挥。
      对仔猪免疫功能的影响
      动物自身需要?#34892;?#30340;防御系统才能避免各种病原微生物造成的侵袭。为抵御各种疾病,需要机体防御系统中各组成部?#20013;?#21516;作用。完整的防御系统包括非特异性防御系统和抗原特异性免疫系统。肠道菌群?#25381;?#20026;人类的“第二基因组”,其与机体淋巴细胞组成了动态微生态系统,起到了保护动物健康,维?#27542;?#36947;正常生理功能。正常肠道菌群可促进免疫系统发育,维持正常免疫功能。协同拮抗病原菌入侵,发挥着重要作用。GOD通过能够调节肠道菌群的数量、菌群比例及肠道内微生态平衡,从而增强了机体对病原菌感染的非特异性免疫防御机能,主要通过两个方面实现。其一是通过产生的H2O2以及酸性?#32938;?#26469;抑制有害菌,从而促进有益微生物群增殖来实现;其二则通过阻止病原菌在胃肠道内繁殖和定植来实现。肠道厌氧菌有利于肠道上皮细胞外层的黏蛋白的?#32622;冢?#20419;进黏膜生成,其将肠道表面封闭形?#21892;?#38556;,阻止细菌与上皮细胞结合进人肠道细胞,并通过肠蠕动将附着在黏膜上的细菌一同排出体外,从而抑制外来细菌生长,促进营养物质的消化吸收,达到改善生长性能、防病治病、提髙机体免疫力的作用。葡萄糖酸经乳酸菌发酵刺激后产生挥发性SCFAs,SCFAs可结合多种GPR分子,诱导Treg细胞和耐受型的DC细胞产生,维?#27542;?#36947;稳态,最终降低Th2、过敏等炎症反应。另外葡萄糖酸能够降低pH值,酸性?#32938;?#26377;助于激活免疫活性细胞及酸性蛋白酶活性、增强机体抵抗力等能力。GOD具有抗氧化作用,可以清除自由基,保护肠道上皮细胞的完整性,降低大肠?#21496;?#27801;门氏菌等感染畜禽的机会,达到防御病原菌侵袭的目的。赵国先等在蛋鸡饲料中添加0.4% GOD?#19978;?#33879;提髙血清总蛋白含量,0.2%~0.4%组?#19978;?#33879;或极显著提高白蛋白的含量。0.4%添加组显著降低了肌酸激酶的活性。同样,在蛋鸡饲料中添加GOD,明显提高总蛋白和白蛋白含量,以0.4%组提髙最明显(P<0.05),?#30452;?#25552;高29.46%、17.53%;GOD添加组能提髙球蛋白、?#23631;?#21644;碱性磷酸酶的含量,降低总胆固醇和?#35270;?#19977;酯水平以及提髙谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性,0.4%添加组显著降低了肌酸激酶的活性。动物机体70%的娀细胞分布挪道内,肠道免疫系统所产生的免疫球蛋白,占动物机体所生产免疫球蛋白的60%。免疫球蛋白是一种抗体蛋白,主要由单?#21496;奘上?#32990;产生,当机体循环抗体含量增加时,血清中球蛋白水平升高,从而提高动物机体抵抗不良?#32938;?#21644;疾病的能力。GOD提髙总蛋白、白蛋白和球蛋?#21331;?#33021;是因为抑制有害菌( 大肠?#21496;?#31561;) 的增殖, 改善肠道缓解,提高肝脏功能, 从而提髙饲料中营养物质的吸收, 为体内蛋白质的合成提供了足够的原料。安文亭等在仔猪日粮中?#30452;?#28155;加10、20 、30U/kgGOD为试验1 、2 、3组, 与对照组相比,试验1 、2 、3组?#20837;?#29976;肽过氧化物酶活性?#30452;?#25552;高25.53% 、41.71% 、48.11%(P<0.05) ; 过氧化氢酶活性?#30452;?#25552;髙9.61% 、39.02% 、18.08%(P<0.05) ;超氧化物歧化酶活性?#30452;?#25552;高5.58% 、20.26% 、31.59%;丙二醛含量?#30452;?#38477;低7.14% 、35.71% 、31.43% 。肝脏的生长发育会直接影响机体的免疫力, 肝脏功能的正常发?#21491;?#36182;于肝脏细胞的结构完整性, 其细胞结构完整性也与抗氧化能力密切相关。肝脏?#20837;?#29976;肽过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性是显示肝脏抗氧化、清除自由基能力的重要生理?#21103;輟?#19993;二醛的含量?#20174;?#33026;质过氧化损伤程度, 其是脂质过氧化的一种重要终产物。GOD通过提高仔猪血清、肝脏抗氧化酶活性和抗氧化物质含量来增强机体和肝脏抗氧化力, 其机制是因为GOD分子中含有FAD,其在氧化还原反应中能够清除自由基, 另外GOD与H2O2酶组成氧化还原系统同样也能够清除自由基, 使猪在生产中表现更?#24247;?#25239;力。
      霉菌毒素不仅对人体健康造成很大危害, ?#19981;?#27745;染饲料原料, 可使畜禽呕吐、拒食, 采食量、增重、饲料报酬、产蛋?#30465;?#21463;精率下降, 还使畜禽免疫受到抑制,造成母猪繁殖障碍, 脏器损伤等, 导致免疫失败, 疾病发生, 效益降低。机体内产生的氧自由基会破坏肠道上皮细胞的完整性造成肠道损伤, 而在GOD催化反应过程中, 可以清除氧自由基, 保护肠道健康, 从而抑制病原菌入侵。GOD也能解除药物中毒, 其作用原理是:一方面GOD作用生成一定量的过氧化氢, 使如黄曲霉毒素这种具备氧杂萘邻酮基团的霉菌毒素被氧化脱氢, 分子结构发生改变, 解除毒性。另一方面通过氧化作用破坏呋喃环结构, 使环打开, 毒性消失, 从而达到脱毒的作用。此外,GOD通过消化道部分进入肝脏, 催化肝脏内的氧化还原反应的发生, 加速了毒性成分的分解。胡常英等用含2000μg/kg浓度黄曲霉毒素B1, 和添加5%25U/g GOD的饲料喂小鸡, 相比对照组, 实验组存活数量提高39.5% , 在小鸡饮用水中加入5% 25U/ mL GOD, 存活数量可提高28.5。汤海鸥等研究也发现, 添加GOD改善了AFB1攻毒肉鸭的生长性能, 显著改善屠宰性能及血液生化?#21103;輳?提高T3 、TSH和GH含量。临床试验表明,GOD可缓解饲料中霉菌毒素的危害, 降低其毒性,一定程度上提高动物的免疫力。
      对猪肠道微生物的影响
      肠道是动物机体最重要的消化器官之一, 是人体的第二大脑, 也是体内最大的免疫器官, 各种营养物质主要在此吸收转运, 经由肠?#26639;?#26579;病原微生物是引起动物死淘的重要原因。肠道微生态平衡是确保动物健康的首要保障, 另外一道保障是肠黏膜的完整性与蠕动。肠道微生态的平衡,尤其是厌氧、耐酸的有益菌(乳酸?#21496;?#21452;歧?#21496;?#31561;)的增殖,进而使相关代谢产物(如乳酸、VFA等)增加,也使pH值趋于下降。肠道的pH值小于6将有利于有益菌的增殖, 抑制有害菌(大肠?#21496;?#27801;门氏菌葡萄球菌等)的增殖。GOD在肠道中耗氧催化葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2, 从而产生厌氧酸性的?#32938;常?促进有益菌乳酸?#21496;?#29983;长的同时, 抑制好氧、不耐酸的病原微生物的繁殖。乳酸?#21496;?#31561;有益菌能够调节肠道微生物区系的平衡,促进肠道的生长和发育。大肠?#21496;?#26159;动物肠道的正常菌群,是调节动物体生态平衡不可缺少的细菌, 然而某些大肠?#21496;?#30340;菌株是致病的原因菌, 其致病与否要看在数量上是否可以?#21152;?#21183;。大肠?#21496;?#22312;pH值为8时最易生长,而降低pH值对其生长有抑制作用。Franco等研究报道, 添加磷酸型酸化剂和乳酸型酸化剂对体外培养的大肠?#21496;?#37329;黄色葡萄球菌和沙门氏菌都有明显抑制作用, 不同比例的富马酸和乳酸使肠道大肠?#21496;?#25968;明显减少。Canibe等研究报道, 酸性条件可以抑制仔猪大肠?#21496;?#31561;有害菌的生长繁殖,有利于乳酸菌的生长繁殖。肖晶在日粮中添加200g/t GOD?#19978;?#33879;降低仔猪胃和十二指肠的pH值和大肠?#21496;?#30340;数量, 增加乳酸茵的数量, 改善十二指肠的绒毛高度。陈清华等在饲粮中添加200g/t 葡萄糖氧化酶可以降低仔猪胃和十二指肠的pH值和大肠?#21496;?#30340;数量增加乳酸菌的数量, 改善十二指肠的绒毛高度。Biagi等试验研究表明, 葡萄糖酸能降低断奶仔猪肠道大肠?#21496;?#25968;量, 增加乳酸菌数量。杨久仙等日粮中添加0.2% 和0.3% GOD可以显著降低仔猪胃和回肠大肠?#21496;?#25968;量(P<0.05), 增加仔猪胃和回肠乳酸菌数量(P<0.05)。
      消化酶是我们细胞的驱动力, 是催化体内数以千计生化反应的蛋白?#30465;?#22823;部分酶在细胞内产生作用,而消化酶则在肠胃道细胞外起作用。蛋白酶( 协助消化蛋白质) 、淀粉酶( 协助消化碳水化合物) 及脂肪酶( 协助消化脂肪) 是三种主要消化酶, 这些酶是动物分解饲料养分的生物催化剂。因此, 动物消化酶?#32622;?#37327;不足和酶活性偏低在很大程度上限制了营养物质消化率的提高, 进而影响动物生产性能潜力的发挥。而影响消化酶的?#32622;?#37327;及活性的因素之一就是肠道pH值,GOD催化反应降?#32479;?#36947;pH值, 提高酶原的激活率, 进而提高消化酶活性。宋海彬等研究发现, 肉鸡日粮中添加0.4% 、0.5% GOD均能显著提高肉鸡消化道淀粉酶和胰蛋白酶(P<0.05)。
      小肠黏膜的上皮绒毛高度和隐窝深度与肠黏膜的吸收能力存在很大的关联,绒毛变短、隐窝变深说明绒毛萎缩,吸收能力下降激毛的高度与隐窝深度比值越大说明肠上皮表面积越大, 消化和吸收能力?#31361;?#36234;强。肖晶在日粮中添加GOD,断奶仔猪空肠、十二指肠的绒毛高度和VH/CD值显著得到提高。此外,GOD催化葡萄糖产生的葡萄糖酸经发酵后产生挥发性短链脂肪酸,不仅能显著提高移植肠绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度及绒毛面积,并能改善移植肠?#22253;?#22522;酸的吸收能力。
      小结
      葡萄糖氧化酶作为一?#20013;?#22411;的饲料添加剂应用,其应用价值逐渐被挖掘, 在畜禽中应用的效果必然是多方面的, 因而评价也应该是多方面的,但目前其评价体系却?#24418;?#23436;善。同时目前葡萄糖氧化酶的生产主要以黑曲霉或青霉发酵为主, 其生产的同时往往需要对菌丝进行破壁,并产生大量杂蛋白,使其分离提取难度上升,进而造成了成本的提髙及活性的降低,限制了其在畜牧养殖业中的应用。然而已经有很多临床试验证明, 葡萄糖氧化酶能够提高畜禽生长性能, 改善动物健康水?#20581;?#38543;着其生产技术方面的日趋成熟及绿色养殖概念的逐渐深入, 可以预见葡萄糖氧化酶将在畜牧养殖中发挥越来重要的作用。
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